萬邦醫(yī)藥分析測試中心在復雜基質(zhì)樣本生物分析技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)深耕了17年，具備了卓越的技術(shù)實力和豐富的實踐經(jīng)驗，包括在低分子量肝素類領(lǐng)域已完成抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性分析方法的方法驗證。

分析測試中心擁有符合中美雙報要求的大小分子生物樣本檢測平臺，嚴格的質(zhì)量管理體系以及一套先進的生物樣本分析設(shè)備，能夠滿足各種復雜的生物樣本分析需求；已經(jīng)完成了超過500項的生物樣本分析實驗，檢測了超過90萬支樣本。我們接受了國家局的20多次核查，并成功獲得了40多次免核查的認可。專業(yè)高效的生物樣本分析團隊，將為您提供藥代動力學生物分析服務(wù)、免疫原性生物分析服務(wù)、藥效學和生物標志物研究等服務(wù)，誠摯歡迎全國各地的朋友前來合作交流。

 低分子肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）主要用于治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥(心絞痛、心肌梗塞等)，同時，在婦產(chǎn)科、生殖科等科室的抗凝血輔助治療中的作用日益突顯。低分子肝素因分子量小、副作用少、抗凝效果好，逐步成為臨床治療的優(yōu)選。隨著人口老齡化，心血管患病人數(shù)增加等原因，使得中國肝素類藥物市場前景廣闊。臨床上常用的低分子量肝素（LMWH）產(chǎn)品有依諾肝素鈉、達肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉和汀肝素鈉等。但因LMWH體內(nèi)劑量與PK關(guān)系尚未闡明，且LMWH為成分復雜的混合物，所以無法以藥代動力學為生物等效性評價的終點指標，需進行人體藥效學生物等效性研究。同時，F(xiàn)DA 通過個藥指南（依諾肝素鈉、達肝素鈉）制定LMWH仿制產(chǎn)品的5 項評價標準，其中第5項為使用抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性作為人體內(nèi)PD終點生物等效性研究的檢測指標。因此，生物樣本中抗Xa因子、抗Ⅱa因子活性是LMWH仿制產(chǎn)品等效性評價的重要依據(jù)。

抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性的生物分析方法一般使用二步顯色法（2 Stages Heparin Assay），其原理是抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）與肝素結(jié)合后，對血漿中凝血絲氨酸蛋白酶（包括Ⅱa因子、Xa因子）的抑制作用會增加（也是肝素的抗凝作用機制）。在AT-Ⅲ、凝血因子（Ⅱa或Xa）過量條件下，肝素與AT－Ⅲ結(jié)合后，再結(jié)合凝血因子，只有未被結(jié)合的凝血因子才能發(fā)揮水解活性，將顯色底物（對硝基苯胺，pNA）從特異性底物中釋放出來。未被結(jié)合的凝血因子與肝素濃度負相關(guān)，最終測定的顯色底物吸光值與肝素濃度呈負相關(guān)。

在實踐中，該類產(chǎn)品的生物分析主要參照配體結(jié)合分析的相關(guān)要求，如9012《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，ICH M10 等。方法學驗證中主要考察項目包括準確度與精密度（包括批內(nèi)考察、批間考察）、選擇性（健康人基質(zhì)、溶血基質(zhì)等）、平行性、定量范圍、稀釋線性和鉤狀效應(yīng)、穩(wěn)定性等。以下簡述六種方法驗證及樣本分析的主要關(guān)注點：

（一）該體系顯色較快，須嚴格控制每步孵育時間及孵育溫度，在操作時用計時器精確到秒，力求優(yōu)異的實驗結(jié)果。

（二）穩(wěn)定性數(shù)據(jù)是方法穩(wěn)定的重要支柱，全面驗證標準品/受試制劑/參比制劑在各條件下的穩(wěn)定性以證明待測物的穩(wěn)定性及方法的耐用性。其驗證項包括：①儲備液穩(wěn)定性；②全血穩(wěn)定性（不同溫度）；③血漿樣本穩(wěn)定性（凍融循環(huán)、不同溫度）；④樣品前處理過程中的穩(wěn)定性；⑤處理后樣品穩(wěn)定性（不同儲存條件）。因涉及到標準品、參比制劑與受試制劑，故穩(wěn)定性樣本是一般項目的3倍，復雜且龐大，需要實驗人員邏輯清晰，步步謹慎。

（三）在以發(fā)色底物法測定抗Ⅱa/Xa活性中，生物樣本不同程度的溶血會對活性檢測有不同程度的影響，使檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此，在方法學驗證時對血漿樣品不同程度的溶血情況進行考察，并拍照留檔為后期試驗提供數(shù)據(jù)支持，為臨床機構(gòu)和分析測試中心提供判斷標準。

（四）血樣的采集與處理也可能會影響血漿中抗Xa因子、抗Ⅱa因子的活性，因此，采血條件、抗凝劑種類及濃度、采血后抗凝管的混勻操作、允許的離心前放置條件（時間、溫度） 、離心條件（時間、溫度、速度） 均須進行提前規(guī)定，并且與分析方法驗證考察時使用的條件一致。

（五）因溶血、脂血、黃疸等樣本均可能干擾抗Xa活性的測定。我們從源頭控制輕柔采血、細心處理樣本，盡量避免溶血。同時建立雙方統(tǒng)一的溶血程度判斷標準并記錄，在樣本交接時的溶血狀態(tài)確認與記錄。

（六）肝素類產(chǎn)品的生物樣品分析通常會使用微孔板，將每個板作為獨立的分析批，使用獨立的校準曲線和質(zhì)控樣品。同一例受試者的全部樣品盡可能分布在同一分析批以減少結(jié)果的變異，如果一塊分析板無法包括全部樣品，分析計劃中應(yīng)規(guī)定同一例受試者樣品在分析批間的分布方案。板位信息、讀板值等原始數(shù)據(jù)均應(yīng)完整保存，并完整匯報。

目前FDA和EMA對等效性評價指標有所差異，主要集中在是否將抗Ⅱa 因子活性作為主要等效依據(jù)以及對等效性的判斷標準。NMPA建議將抗Xa因子活性作為主要PD等效性評價依據(jù)、抗Ⅱa因子活性作為支持性依據(jù)，但對分子鏈相對較長的LMWH產(chǎn)品需要同樣考慮評價抗Ⅱa 因子活性。因此，在LMWH 生物樣本分析中，須同時檢測抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性，并在總結(jié)報告中匯報。

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